将生物活性物质（如核酸、肽/蛋白质和小分子）有效转运到细胞中，是治疗癌症、遗传性疾病和COVID-19的一种有前景的治疗方法。自20年前以来，已开发出多种富含精氨酸的细胞穿透肽（CPPs），用于转运生物活性物质。然而，CPPs可能具有细胞毒性，容易滞留在内涵体中，且核酸和CPPs之间的静电相互作用也会阻碍核酸胞内释放。与此同时，胍官能化阳离子聚合物可增强复合物的稳定性，但也会阻碍细胞中活性物质释放。基于此，开发具有高细胞外稳定性、在细胞质中触发释放的响应性CPPs有望解决上述问题。虽然目前报道了一些响应外部刺激的动态共价连接链，然而它们中的大多数合成过程耗时长、条件苛刻，且需要有机溶剂，可能会影响活性物质的活性。二硫键由于较小的细胞毒性以及容易被内源性谷胱甘肽（GSH）降解，越来越多的应用于基因递送的载体。为生物可降解的二硫聚合物开发一种简单、高效和安全的合成方法对于生物大分子递送系统非常重要。

基于上述研究背景，北京化工大学徐福建/俞丙然团队开发了一种简单、安全和可控的二硫键交换聚合以合成生物可降解的细胞穿透聚胍（mPEG225-b-PSSn）的方法。随后对该细胞穿透聚胍的生物相容性、响应降解性及转染性能进行了评估，从而确定最优的聚胍。一系列的体内外实验表明PEG 225-b-PSS 26具有优秀的基因递送能力，抗菌活性及安全性。相关工作以“Controllable Disulfide Exchange Polymerization of Polyguanidine for Effective Biomedical Applications by Thiol-Mediated Uptake”发表在《Angew. Chem. Int. Ed.》。

作者首先将 L-精氨酸甲酯与硫辛酸结合来合成二硫化物单体（图1）。二硫交换的聚胍反应在二硫化物单体和甲氧基聚乙二醇（mPEG-SH）间进行（500:1）。通过调节亲核试剂的浓度及反应时间，成功制备了一系列细胞穿透聚胍（mPEG225-b-PSSn，n = 13, 26, 39, 75, 105）。通过NMR、GPC等对其结构和聚合度进行了验证，并对二硫交换的聚胍反应机理进行了推理。

图1：二硫交换聚合法可控制备聚胍及其生物医学应用。

随后研究人员对PEG 225-b-PSS n的生物相容性进行了考察（图2）。MTT细胞毒性实验以及溶血实验发现，n=75或105时PEG 225-b-PSS n显示出较大的细胞毒性并导致溶血。而n = 13, 26, 39时，安全性较好。此外，还对聚胍的可降解性能进行了考察。在NaBH 4或GSH等还原条件下，该聚胍都能很好的降解，释放出包载的pDNA。

图2：(a) 4T1细胞生存率。(b)溶血率。(c) mPEG225-b-PSSn降解前后的1H-NMR。(d) 降解前后不同R/P比的凝胶迁移滞后实验。(e) R/P比为10时mPEG225-b-PSS26/pDNA降解前后的AFM。(f) GSH存在或不在时pDNA释放行为。

有效的基因转染对于基因治疗至关重要。基于此，作者考察了mPEG 225-b-PSSn的基因转染效率，其中mPEG 225-b-PSS 26显示出最高的基因转染效率。相比较PEI，mPEG 225-b-PSS 26更好的实现细胞内化，以利于基因转染。进一步研究发现，聚胍的摄取可能与巯基介导的传递机制有关。此外，mPEG 225-b-PSS 26 还显示优秀的基因递送和表达能力，通过转染pKR-p53和pEGF，分别显示出显著的光毒性和促进细胞迁移和增殖的能力（图3）。

图3：(a) 4T1细胞摄取激光共聚焦图。(b)流式图。(c) 4T1细胞中转染mPEG225-b-PSS26/pKR-p53后Killer Red蛋白表达。(d) 4T1细胞存活率。(e) 蛋白质印迹：P53和Killer Red蛋白的表达。(f) L929细胞划痕实验。(g) L929细胞增殖。(h) Elisa测L929细胞中EGF浓度。

最后，研究人员考察了该细胞穿透聚胍的生物医学应用。在4T1荷瘤 BALB/c 裸鼠模型中，mPEG 225-b-PSS 26/pKR-p53显示出很好的基因表达能力、抑制肿瘤活性及安全性（图4）。体外抗菌模型中，PEG 225-b-PSS 26对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出优异的抗菌活性。全层皮肤缺损和感染模型中，创面愈合的快慢表现为mPEG 225-b-PSS 26/pEGF＞mPEG 225-b-PSS 26/pNC＞未处理组，这可能与mPEG 225-b-PSS 26的抗菌能力及pEGF的有效表达促进创面愈合有关（图5）。

图4：(a) 4T1荷瘤 BALB/c 裸鼠模型及治疗概括。(b)14天时不同处理组肿瘤图。(c) 0-14天肿瘤体积变化。(d) 14天不同处理组的肿瘤体积。(e) BALB/c 裸鼠体重变化。(f) 免疫组化及HE染色。

图5：(a) 全层皮肤缺损和感染模型的建立及治疗示意图。(b) 0, 3, 6, 10天时的伤口图。(c) 0-10天不同处理组伤口动态变化图。(d) 金黄色葡萄球菌菌落统计。(e) 金黄色葡萄球菌感染的组织菌落形成。(f) 6天、10天检测组织中的EGF浓度。(g) 第6天伤口组织HE染色、EGF免疫-荧光染色、Masson染色

总之，本文开发了一种可控、高效、温和的二硫键交换聚合的方法。通过调节亲核试剂（硫醇根离子，R-S -）的浓度和反应时间，成功制备了一系列可生物还原的细胞穿透聚胍（mPEG225-b-PSSn，n = 13, 26, 39, 75, 105）。随后对PEG 225-b-PSS n 的生物相容性、响应降解性及转染性能进行了评估，从而确定最优的聚胍，以便更进一步的生物应用。其中PEG 225-b-PSS 26显示出对pKR-p53和pEGF 的良好转染性能和递送能力。另外，PEG 225-b-PSS 26还对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出优异的抗菌活性。最后，体内抗肿瘤和伤口愈合实验进一步证实了PEG 225-b-PSS 26优秀的基因递送能力、抗菌活性及安全性。

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全文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202200535

来源：高分子科学前沿

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