黄柏 Phellodendri Chinensis Cortex 为芸香科黄柏属植物黄皮树 Phellodendron chinense Schneid. 的干燥树皮，其广泛分布于中国西南地区，又习称“川黄柏” [1-2] 。关黄柏 Phellodendri Amurense Cortex 为芸香科植物黄檗 P. amurense Rupr. 的干燥树皮 [1] 。两者均为常用中药，其具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮等作用，常用于湿热 泻痢、黄疸尿赤、带下阴痒、热淋涩痛、脚气痿壁、骨蒸劳热等症 [3] 。《中国药典》 2000 年版及之前各版本《中国药典》中“川黄柏”和“关黄柏”均收载于黄柏项下 [4] ，而自从《中国药典》 2005 年版开始，“川黄柏”和“关黄柏”被分列为 2 种药材 [5] 。

尽管被《中国药典》分列开来，黄柏与关黄柏的性味与归经及功能与主治相同。两者中的主要化学成分均为生物碱，如小檗碱、木兰花碱、药根碱等 [6-9] 。此外，其具有相似的生物活性或药理作用如抗菌、利尿、调血压、降血糖、抗氧化等 [10] 。因此临床应用上并未特别强调二者的差别，药材市场及成方制剂中也存在混用现象 [11] 。由于地理和历史的原因，中药药材品种混乱，基原复杂，加之中药的同名异物或同物异名现象普遍存在，甄别药材优劣、鉴别真伪变得异常困难 [12] 。然而，《中国药典》目前还没有强调对同源近属品种进行区分。而国际主流药典，如《美国药典》和《欧洲药典》均注重利用薄层色谱、指纹图谱或特征图谱等分析手段，从化学成分的角度鉴别同源近属品种，从而达到甄别真伪优劣的目的 [13] 。

为推动黄柏现代化及国际化进程，建立有效的、能被国际社会认可的质量控制标准，促进黄柏临床用药的安全性和有效性，本研究利用高效液相色谱（ HPLC ）建立了黄柏的特征图谱，并在特征图谱的基础上建立了一测多评的方法，用于测定黄柏中黄柏碱、木兰花碱和小檗碱的含量，阐明黄柏和关黄柏主要化学成分差异性。此外，为进一步验证和筛选差异性化合物，本研究结合化学计量学方法如主成分分析（ principal component analysis ， PCA ）和正交偏最小二乘判别分析（ orthogonal partial least squares discriminant analysis ， OPLS-DA ）对黄柏和关黄柏的特征图谱数据进行了比较分析。本研究系统阐明了易混淆品种黄柏和关黄柏的化学成分的差异性，所建立的特征图谱和一测多评含量测定方法能准确区分两者，可作为中国药典修改标准的参考，用于黄柏的质量控制。

1材料与仪器

1.1材料

27 批黄柏药材采集于四川（ HB-1 ～ HB-15 ）、湖南（ HB-16 ～ HB-22 ）、广西（ HB-23 ～ HB-27 ），经湖南中医药大学龚力民副教授鉴定为芸香科植物黄皮树 P. chinense Schneid. 的干燥树皮； 6 批关黄柏药材分别采集于吉林（ GHB-1 ～ GHB-2 ）、辽宁（ GHB-3 ～ GHB-4 ）和黑龙江（ GHB-5 ～ GHB-6 ），经湖南中医药大学龚力民副教授鉴定为芸香科植物黄檗 P. amurense Rupr. 的干燥树皮；对照品盐酸小檗碱（批号 ST03070120 ）、盐酸巴马汀（批号 ST03040120 ）、盐酸黄柏碱（批号 ST08670120 ）、盐酸药根碱（批号 ST03080120 ）、木兰花碱（批号 ST15050120 ）均购于上海诗丹德标准技术服务有限公司，所有对照品质量分数均大于 98% ；色谱级甲醇和乙腈购于美国 Sigma-Aldrich 公司；水为纯净水（华润怡宝饮料有限公司） 。

1.2仪器

Mettler-Toledo AE100S 型电子天平（梅特勒 - 托利多公司）； KQ2200DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； Agilent 1260 高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司，配备二极管阵列检测器）； Waters e2695 高效液相色谱仪（沃特世公司，配备 2489 UV/Vis 检测器）； Waters Atlantis® T3 色谱柱（ 250 mm × 4.6mm ， 5 μm ， Waters 公司）； Agilent 5 TC-C18 色谱柱（ 250 mm × 4.6 mm ， 5 μm ，安捷伦科技有限公司）； Agilent Poroshell EC-C18 色谱柱（ 250 mm × 4.6 mm ， 4 μm ，安捷伦科技有限公司）。

2方法与结果

2.1供试品溶液的制备

黄柏和关黄柏药材粉碎后过四号筛，取样品粉末 0.25 g ，精密称定，置于 25 mL 锥形瓶中，加 10 mL 盐酸甲醇溶液（ 1 ∶ 100 ），超声提取 30 min ，取上清液离心后用 0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.2对照品溶液的制备

分别取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、木兰花碱、盐酸黄柏碱适量，精密称定，置于 10 mL 量瓶中，用盐酸甲醇溶液（ 1 ∶ 100 ）溶解并定容，即得对照品储备液，将其置于 4 ℃冰箱中保存，备用。用移液管吸取不同体积的各对照品溶液，于 10 mL 量瓶中混合后定容，得到不同质量浓度的混合对照品溶液，备用。

2.3色谱条件

色谱柱： Waters Atlantis® T3 （沃特世公司， 250 mm × 4.6 mm ， 5 μm ）；流动相为乙腈（ A ）和 0.3% 磷酸 -0.3% 三乙胺溶液（ B ）；梯度洗脱： 0 ～ 25 min ， 10% ～ 25% A ； 25 ～ 40 min ； 25% ～ 40% A ； 40 ～ 55 min ， 40% ～ 95% A ； 55 ～ 65 min ， 95% A ；柱温 20 ℃；体积流量 0.8 mL/min ；波长 230 nm ；进样量 2 μL ；黄柏和关黄柏的高效液相色谱图如图 1 所示。

2.4特征图谱建立

2.4.1精密度考察 按“ 2.1 ”项下供试品溶液制备方法，制备同一份样品（ HB-1 ）溶液，吸取 2 μL ，按 “ 2.3 ” 项下的色谱条件连续进样 6 次分析，记录其色谱图。以 9 号峰（盐酸小檗碱）为参照，计算各色谱峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间的 RSD 小于 1.35% ，各色谱峰相对峰面积的 RSD 中，只有 3 号峰略大于 3.00% ，为 3.04% ，其余均小于 3.0% ，说明该方法精密度良好。

2.4.2稳定性考察 取同一供试品（ HB-1 ） 溶液，吸取 2 μL ，分别于 0 、 2 、 4 、 8 、 12 、 24 h ，按“ 2.3 ”项下的色谱条件进样分析，记录其色谱图。以 9 号峰（盐酸小檗碱）为参照，计算各色谱峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间的 RSD 小于 1.05% ，各共有峰相对峰面积的 RSD 小于 2.88% ，该方法稳定性良好。

2.4.3重复性考察 取同一样品（HB-1 ），按“2.1 ”项下样品溶液制备方法，平行制备样品溶液6 份，吸取2 μL ，按“2.3 ”项下的色谱条件连续进样6 次分析，记录其色谱图。以9 号峰（盐酸小檗碱）为参照，计算各色谱峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间的RSD 小于0.17% ，各共有峰相对峰面积的RSD 小于2.11% ，该方法稳定性良好。

2.4.4耐用性考察 取同一供试品溶液，分别利用 3 根不同柱子，在 2 台不同仪器按“ 2.3 ”项下的色谱条件进行进样分析并记录其色谱图。以 9 号峰（盐酸小檗碱）为参照， 2 号峰和 3 号峰相对保留时的 RSD 分别为 8.60% 和 8.34% ，其余各色谱峰相对保留时间 RSD 均小于 4.97% ，尽管 1 、 2 号峰受色谱系统影响较大，但是各色谱峰出峰顺序不变。

2.4.5特征图谱的建立 按“2.1 ”项下方法制备供试品溶液，并按“2.3 ”项下色谱条件进行进样分析，记录各色谱图。将色谱图导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A 版”进行匹配，并生成黄柏及关黄柏的对照图谱（图2 ）。 从特征图谱可看出，关黄柏中盐酸小檗碱（ 9 号峰）的峰面积要明显低于黄柏。黄柏样品中盐酸巴马汀吸收峰强度十分低，并且部分样品中无法检出盐酸巴马汀。此外，可以看出，黄柏中 7 号峰的吸收强度大于关黄柏，而 2 号峰的吸收强度相对较小。即这些成分为鉴别黄柏与关黄柏的关键成分，将未知样品的色谱图与对照图谱进行比较，可定性鉴别黄柏和关黄柏。

2.5 PCA与OPLS-DA

2.5.1PCA 将上述特征图谱峰面积导入 Simia-P 14.1 进行 PCA ，从其得分图（图 3 ）可以看出，黄 柏与关黄柏之间区分明显，从而验证了黄柏与关黄柏之间化学成分差异较大。其载荷图中， 2 、 7 、 9 、 10 号峰离原点较远，表明这些成分对各样品在得分图上的分布影响较大，即黄柏和关黄柏中这些成分含量的差异性较大，这些成分可作为鉴别黄柏与关黄柏的标志物。

2.5.2OPLS-DA 将各样品特征图谱数据导入到Simca-P 14.1 中进行OPLS-DA ，得到其得分图与变量贡献度图（Variable important in projection ）。其得分图中（图4 ），黄柏与关黄柏分布区分明显，进一步验证了黄柏与关黄柏化学成分的差异性，同时，2 、7 、9 、10 号峰VIP 值较大，其中2 号和9 号峰VIP 值大于1 ，进一步确认了该4 个成分可作为鉴别黄柏与关黄柏的标志物。

2.6多指标成分的测定

上述已经建立区分黄柏与关黄柏的方法，但其无法区分黄柏样品质量的优劣，为了对黄柏更好地进行质量控制，在特征图谱的基础上，建立了一测 多评的方法测定盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸小檗碱 3 个主要成分含量。其供试品制备、对照品溶液制备、色谱条件分别如“ 2.1 ”“ 2.2 ”“ 2.3 ”项下所示。

2.6.1精密度、稳定性及重复性试验 精密度、稳定性及重复性测定方法同“ 2.4 ”项，记录盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸小檗碱 3 个主要成分的峰面积，并计算其质量分数的 RSD 值。结果表明，各成分精密度的 RSD 均小于 2.53% 、稳定性的 RSD 值均小于 1.68% 、重复性的 RSD 值分别小于 1.92% ，说明该方法稳定、可靠。

2.6.2线性方程、定量限与检测限 将对照品储备液进行稀释，制备 6 份不同质量浓度的混合对照品溶液，按“ 2.3 ”项下色谱条件进行分析，以峰面积为纵坐标（ Y ），质量浓度为横坐标（ X ），绘制标准曲线。将对照品溶液进行逐级稀释，分别以性噪比的 3 倍和 10 倍计算检测限与定量限，结果见表 1 。

2.6.3加样回收率试验 精密称取同一样品（ HB1 ） 9 份，分别加入盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸小檗碱高、中、低各 3 份，按“ 2.1 ”项下方法制备样品溶液，并按“ 2.3 ”项进行进样分析，盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸小檗碱加样回收率在 95.0% ～ 106% ， RSD 小于 0.5% ，说明该方法准确度良好。

2.6.4一测多评方法建立

（1）相对校正因子计算：利用上述线性关系研究中 6 个不同质量浓度的对照品溶液的分析结果，以盐酸小檗碱为参照物，按下列公式计算盐酸黄柏碱和木 兰花碱的相对校正因子（ RCF ），其中 F s 和 F x 分别表示参照化合物和待测化合物的单位响应值， A s 、 A x 分别为参照化合物与待测化合物的峰面积， C s 和 C x 分别为参照化合物和待测化合物的质量浓度。计算得到盐酸黄柏碱和木兰花碱的 RCF 平均值分别为 2.071 6 、 0.822 1 ，其 RSD 分别为 2.29% 、 3.00% 。

RCF ＝ F s /Fx ＝ (As/Cs)/(Ax/Cx)

（2）耐用性考察：分别利用3 根不同色谱柱，在2 台不同仪器按“2.3 ”项下的色谱条件进行进样分析并记录同一混合对照品溶液色谱图。 以盐酸小檗碱（9 号峰）为参照，盐酸黄柏碱和木兰花碱的RCF 平均值分别为2.106 8 、0.844 6 ，其RSD 分别为2.43% 、0.73% 。

2.6.5样品含量测定 所有样品按“ 2.1 ”制备供试品溶液，并按“ 2.3 ”项色谱条件重复进样 3 次分析，按一测多评法计算含量，取平均值，各批次样品含量测定结果如表 2 所示，各批次黄柏中盐酸小檗碱的含量差异较大，为 2.34% ～ 6.89% ，其质量分数明显高于关黄柏（ 0.77% ～ 1.74% ）。

除了样品 HB-11 为异常样品外，其余各批次黄柏中总生物碱量（以盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸小檗碱计）为 3.21% ～ 7.70% ，明显高于关黄柏（ 1.09% ～ 2.83% ）。利用这些特征也可以鉴别黄柏与关黄柏，该实验结果也说明黄柏和关黄柏中主要化学成分均为生物碱，其中盐酸小檗碱含量最高，但是各批次黄柏样品中盐酸小檗碱含量差异大，为保证黄柏临床用药的有效性，有必要对黄柏中盐酸小檗碱的含量进行限定。

3讨论

针对市场和临床应用中黄柏与关黄柏存在混用的情况，本实验建立了能区分鉴别黄柏与关黄柏的特征图谱，并结合 PCA 和 OPLS-DA ，确认了黄柏和关黄柏的差异性化合物为木兰花碱（ 2 号峰）、盐酸小檗碱（ 9 号峰）、盐酸巴马汀（ 10 号峰）以及一未知化合物（ 7 号峰），通过分析特征图谱中这些化合物的色谱吸收强度可准确鉴别黄柏和关黄柏。

此外，本实验建立的一测多评方法可有效测定黄柏和关黄柏中主要有效成分盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱和木兰花碱的含量。 27 批次黄柏样品中三者的质量分数分别为 2.34% ～ 6.89% 、 0.19% ～ 0.69% 和 0.03% ～ 0.29% 。黄柏中盐酸小檗碱的含量明显高于关黄柏，其 3 个生物碱的总含量也相对较高。鉴于黄柏和关黄黄柏中主要有效成分生物碱存在较大差异，两者的临床疗效应该也有所不同，因此，在临床用药中，黄柏和关黄柏应区别使用。

目前对单一成分的含量测定已经难以满足质量控制的需求，在中药或植物药的质量控制中，国际上主流药典标准均强调对其中的多指标成分进行含量测定，此外，中药基原复杂，中药要想被国际主流药典认可并走进国际市场，就必须建立合适的方法对齐其同源近属品种进行区分。本实验建立的黄柏特征图谱及一测多评法能够在有效的区分其易混淆品种关黄柏的同时，对其多指标活性生物碱进行含量测定，本研究可为黄柏的现代化和国际化提供参考依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：袁汉文，吕梦颖，罗江溢，邱伊星，刘 杨，彭彩云，王 炜．基于特征图谱和一测多评法的黄柏质量控制研究 [J]. 中草药, 2022, 53(17): 5491 -5 497 .

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